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[方法]1．將電轉(zhuǎn)化儀設(shè)置為200D（電阻）、25rtF（電容）和2．5kV。2．在冰上復(fù)溶電感受態(tài)細菌或使用新鮮制備的電感受態(tài)細胞。將電轉(zhuǎn)化杯、杯固定夾、細胞和DNA均放于冰上。3．將80ng已純化且無鹽的DNA與50g1細菌混合。冰上孵育混合物1分鐘。4．將混合物轉(zhuǎn)移至0．2cm間距的電轉(zhuǎn)化杯中，小心操作切勿在電極間留氣泡。輕拍小杯，使所有液體均沉淀于瓶底。迅速轉(zhuǎn)移以使小杯處于低溫狀態(tài)。5．將透明杯放入電轉(zhuǎn)化儀內(nèi)，確保小杯側(cè)面干燥（以免電弧）。啟動脈沖，立即加入1．0ml...
抗體文庫儲存料中制備噬菌體。在開始實驗之前，先用滴定法（在TYE/amp/glu平板上系列稀釋鋪板）計算每毫升抗體文庫儲存料中細菌的數(shù)目。在600nm（A600）處的某個特定吸光值下，抗體文庫中細菌數(shù)目較未感染細菌數(shù)目低一些。這或許是因為含有質(zhì)粒的文庫細菌體積更大，或者是存在死細菌。一旦滴度與A600確定關(guān)系，吸光值即可用于細菌數(shù)目的計算。對于噬菌體的制備（文庫救援），來自文庫儲存料的起始接種量應(yīng)比文庫容量大5倍。接種到培養(yǎng)基后，細菌濃度的A600不應(yīng)超過0．05。采用文庫容...
1．在每毫升zui后的噬菌體懸液（例如來自實驗方案13．11）中，加入0．45g氯化銫，充分混勻至溶解。2．用吊桶式轉(zhuǎn)頭（或與其相當(dāng)?shù)男吞枺╇x心溶液，15℃17h，噬菌體將濃縮在組分1和組分2中（。組分1的濃度較高，但組分2的體積較大。用巴氏滴管或塑料注射器吸取這些組分。如果是*次使用本實驗方案，那么先收集所有條帶并分別對其檢測將是明智之舉。3．將收獲的溶液對PBS透析過夜。4．通過感染大腸桿菌DH5cF，或TGl滴定各個不同組分中噬菌體，并保存滴度zui高的組分。通常，噬菌...
從噬菌體抗體文庫中分離抗原特異性抗體，是通過讓噬菌體進入到在抗原上進行的重復(fù)性選擇循環(huán)來實現(xiàn)的。理想情況下，僅需l輪選擇即可完成。但事實是，絲狀噬菌體常常非特異性地結(jié)合到支持物表面，從而限制了每輪所能獲得的富集水平。實際上，需要2～5輪的選擇。現(xiàn)在已設(shè)計了許多各自不同的選擇方法；其中包括在固相支持物上包被抗原進行生物淘選，使用免疫親和層析注或BIAcore傳感芯片，用生物素化抗原選擇E37J，多肽E383，在固定的原核生物E393或哺乳動物E403細胞、組織培養(yǎng)細胞E41-4...
1．按每孔100pl蛋白抗原包被微量滴定板，4℃過夜。PBS中10ug／m1的濃度是包被抗原的標準濃度。但有時需要更高的濃度或者不同的包被緩沖液（比如碳酸鹽緩沖液）。2．棄去抗原液并用PBS洗滌板孔2次。3．加入200gl的2％MPBS封閉每個板孔，37℃孵育2小時。4．用PBS洗滌板孔3次。5．每孔加入50ul的4％MPBS。6．每孔加入50ul含可溶性抗體的培養(yǎng)基上清，用移液器反復(fù)吹吸混勻，室溫孵育1小時。7．棄去溶液，用PBS／Tween洗滌板孔3次，再用PBS洗滌3次...
噬菌體展示可使抗體親和力提高到1000倍以上。很典型的起始點是自噬菌體抗體文庫中分離特異性抗體。為完成親和力的成熟（親和力的增加），要對抗體序列進行多樣化；突變基因文庫展示在絲狀噬菌體表面上，并在抗原上選擇具有更高親和力的結(jié)合性抗體。盡管整個過程已相當(dāng)清晰，但研究者在進行體外親和力成熟前必須明確：提高特定抗體親和力將會產(chǎn)生預(yù)期的生物學(xué)效果。當(dāng)嘗試用抗體中和循環(huán)中的毒素或生長因子時，更高的親和力就顯得特別重要。在此情況下，抗體與抗原都分布于同樣的區(qū)域，能使抗原抗體的相互作用達到...
利用含有目標受體的復(fù)雜混合物，對噬菌體展示肽文庫進行篩選。這適用于許多令人感興趣的生物體系，如血清、腦脊液及其他生物性體液和細胞或組織表面等。在此情況下，目標就是要鑒定出結(jié)合于特定受體分子或結(jié)合于一組具有特定性質(zhì)的受體上的多肽。我們及他人都在致力于鑒定那些可與疾病特異性相關(guān)的抗體（疾病特異性抗體，DS-Ab）相結(jié)合的多肽。這里我們所描述的方法，是用來鑒定丙型肝炎感染（HCV）特異性相關(guān)抗體的相應(yīng)配體。HCV是一種性慢性肝病的主要病因。利用來自HCV感染者和非感染者的血清（以下...
實驗過程的zui后步驟是以合成每一個結(jié)合性或定位性的多肽來作為熒光標記多肽[典型的熒光素或若丹明（rhodamine）]，然后在靜脈注射后測定其生物分布的。熒光標記也使得多肽能在隨后的沒有任何修飾的受體分離中被使用：可以使用熒光多肽在基于細胞的表達性克隆系統(tǒng)中分類受體陽性的細胞，并且也可以通過高親和性的鼠抗熒光素單抗體的使用把熒光多肽直接固定到固體基質(zhì)上。在有偶合劑（couplingreagent）HATU（Sigma）和DMF（Sigma）的情況下，加入異硫氰酸熒光素I（f...
當(dāng)前位置：
